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人乳头瘤病毒感染者阴道微生态状况

来源:
时间:2019-12-08 03:30
作者:admin666
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人乳头瘤病毒(HPV)是目前被确定的可引起宫颈癌的病因。所以控制HPV感染可以有效控制宫颈癌的发生[1]。人类的皮肤黏膜是其天然宿主,皮肤和黏膜的破损是HPV感染的启动条件,HPV病毒通过受损的上皮组织进入基底层细胞,在细胞内复制繁殖,其复制周期受到严格的调控,并依赖于病毒编码的蛋白质和宿主上皮细胞的分化程度[2]。皮肤和黏膜是预防HPV感染的第一道屏障,任何影响和破坏这道屏障的因素都可以诱发HPV的感染。阴道微环境是黏膜屏障新陈代谢的基础,所以阴道微环境与HPV的感染有很密切的关系[3]。本课题对462位患者的宫颈上皮脱落细胞进行HPV基因分型检测和阴道炎检测,并对感染结果进行综合分析,为本地区女性有效预防HPV感染提供科学依据。

1资料与方法

1.1一般资料2017年3月至2018年3月在我院自愿进行HPV基因分型检测的462例女性患者,年龄20~82岁,其中30~50岁女性最多。严格按照试剂说明书或微生物采集手册采集方法及注意事项采集,运送及贮存标本。采用PCR-反向点杂交技术检测HPV-DNA的分型情况,使用阴道炎联检试剂盒(化学反应法)检测阴道微生态情况。1.2仪器与试剂HPV分型基因测试盒和ABIStepOnePlus基因扩增仪均由艾康生物科技有限公司提供;分子杂交仪购自兴化市分析仪器厂;台式高速冷冻离心机来自湖南湘仪实验仪器开发有限公司;式恒温器,微型混合器,微型离心机均来自海门市其林贝尔仪器制造有限公司,移液器由赛默飞世尔仪器有限公司提供。1.3方法1.3.1样本采集及保存:先按照阴道炎联检试剂盒使用说明书标本采集要求,采集白带标本。再由医生以扩阴器暴露宫颈口,先用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去,检测标本为宫颈黏膜上皮细胞,最好为鳞-柱交界处的上皮细胞。取柔软的宫颈刷伸入宫颈,通过鳞-柱交界处,直到看不到刷子头,旋转10~20s,取出,将其放入细胞保存液中,密闭送检,并注明惟一编号,将两份标本同时尽快送检。1.3.2阴道炎联检试剂盒检测检测方法及结果判读:将沾有标本的拭子取出,置于反应管中加6滴标本提取夜,反复挤压棉签使样本溢出。将溢出标本液滴于测试卡的孔位于35~37℃温育15min,然后在β-N-乙酰氨基酸葡萄糖苷酶(NAG)和唾液酸酐酶(SNA)滴加一滴显色夜,2min后立即判读结果。过氧化氢酶H2O2显示紫红色为阴性,提示正常,不显色表示阳性,提示菌群失调;白细胞酯酶(LE)不显色表示阴性,提示正常;显蓝色或绿色表示阳性,提示有炎症;PH值>4.5为异常,有利于致病菌侵入及生长;β-葡聚糖醛苷酸酶(GUS)不显色表示阴性,提示正常;显蓝色或绿色表示阳性,提示有大肠埃希菌等需氧菌感染;唾液酸酐酶(SNA)不显色或显黄色表示阴性,提示正常;显蓝色或绿色表示阳性,提示有无猪猪哥心水细菌性阴道病;β-N-乙酰氨基酸葡萄糖苷酶(NAG)不显色表示阴性,提示正常;显黄色表示阳性,提示阴道保护性黏膜蛋白屏障被破坏,阴道黏膜处于易感状态或已被白色念珠菌等微生物感染。1.3.3HPV-DNA的提取及扩增:取出保存的标本平衡室温1~2h,对标本和对应1.5ml离心管管进行惟一编号,震荡混匀标本,取1ml混悬液于已编码的1.5ml离心管中12000r/min离心10min,去上清液加50μl核酸提取液,100℃干浴器10min后12000r/min离心10min,取5μl核酸提取液加入45μl的核酸反应液,扩增产物如不能立即使用,密封放于-20℃冰箱保存备用。扩增时间设定为:50℃2min;95℃15min;94℃30s,45℃1min,72℃30s,进行50个循环;72℃延伸10min。1.3.4杂交、洗膜和显色:按照杂交液试剂配置说明新鲜配置溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、结合液和显色液。杂交:将5ml溶液Ⅰ加入到15ml塑料管中,膜条按照样本编码进行标记放入15ml塑料管中,然后依次加入50μlPCR扩增产物,拧紧盖子,于42℃杂交仪中杂交60min,同时将50ml溶液Ⅱ于杂交仪中预热至42℃。洗膜:杂交结束后取出膜条,转移至预热50ml溶液Ⅱ的管中,42℃杂交仪中洗涤10min。显色:新鲜配置结合液,膜条装入结合液管中,于室温摇床轻摇10min;取出膜条放入50ml溶液Ⅰ管中室温轻摇洗2次,5min/次,再用50ml溶液Ⅲ室温摇洗2min。新鲜配置显色液,将膜条浸泡于显色液中轻摇5~10min,最后将膜条移至纯水中终止显色。将膜条展开在白纸上,根据检测位点的信号观察结果。1.4统计学分析应用SSPS24.0统计软件,计数资料比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.190例感染HPV患者的基因型构成462例患者进行25种HPV基因型检测,其中包括14种高危型:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73;3种疑似高危型:HPV26、53、66;8种低危型:HPV6、11、40、42、43、44、81、83。除高危型HPV45和低危型HPV40无人感染外,其余类型均有感染。462例患者HPV阳性感染率为19.5%(90/462%),感染高危型HPV的患者65例,感染率为14.1%(65/462%),占HPV阳性的72.22%(65/90%),感染低危型HPV的16例,感染率3.5%(16/462%),占HPV阳性的17.78%(16/90%);感染疑似高危型HPV的9例,感染率1.9%(9/462%),占HPV阳性的10%(9/90%)。单一型感染有61例,占HPV阳性的67.78%(61/90%)两型及以上感染的有29例,占HPV阳性的32.22%(29/90%)。2.290例感染HPV患者不同年龄段HPV型别感染情况90例HPV感染阳性患者检出不同型别数合计122次,对多重感染者,各型别分别单独计算[4]。20~<30岁、30~<40岁、40~<50岁和50~<60岁4组感染HPV患者数比较,40~<50岁最多56例,30~<40岁有34例感染,20~<30岁有16例,50~<60岁有13例感染,65岁和82岁分别有1例感染HPV16型,1例72岁患者感染HPV31型。表2显示高危型HPV16是感染最多的型别,感染率为16.39%(20/122%),明显高于其他HPV型别。见表2。2.3HPV感染的试验组与体检的对照组女性微生态状况比较(HPV感染组过氧化氢酶(H2O2)阳性45例,阳性率为50.0%,未感组过氧化氢酶(H2O2)阳性65例,阳性率为17.5%;感染组白细胞酯酶(LE)阳性90例,阳性率为100%,未感组白细胞酯酶(LE)的阳性214例,阳性率为57.5%;感染组中阴道分泌物ph值>4.5的人群有79例,占总数的88%,未感组中阴道分泌物pH值>4.5的人群为223例,占总数的为59.9%;感染组β-葡聚糖醛苷酸酶(GUS)阳性40例,阳性率为44.5%,对照组β-葡聚糖醛苷酸酶(GUS)阳性93例,阳性率为25.0%;感染组中唾液酸酐酶(SNA)阳性有40例,阳性率为44.4%,未感组中唾液酸酐酶(SNA)阳性有93例,阳性率为25.0%;感染组中β-N-乙酰氨基酸葡萄糖苷酶(NAG)阳性有38例,阳性率为42.2%,未感组中β-N-乙酰氨基酸葡萄糖苷酶(NAG)阳性有102例,阳性率为27.4%,差异均有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

HPV广泛存在,人类的HPV感染率很高。在自然人群中,HPV感染率从低于1%到高达50%,在性活跃人群中20%~80%的人有HPV感染史[4]。HPV侵入人体后,停留于感染部位的皮肤和黏膜中,并进行增殖,不进入血液,也不产生病毒血症[5]。20世纪70年代德国人哈拉尔德·楚尔·豪森提出HPV与宫颈癌有关系,1995年国际癌症学会确定:HPV是宫颈癌的主要病因。2008年10月6号哈拉尔德·楚尔·豪森因发现HPV获得诺贝尔奖。此后经过科学家及医学专家多年的研究证明,高危型HPV(人乳头瘤病毒)持续感染是诱发宫颈癌发生发展的的比较明确的病因。癌症面前预防远远大于治疗,所以预防HPV的感染和帮助HPV感染者消除病毒使HPV感染者转阴是为女性预防宫颈癌发生的有效的措施[6,7]。女性正常的阴道微生态是由正常局部解剖、正常阴道菌群、内分泌的周期性变化及宫颈部的免疫系统组成。其中阴道菌群是在人的体表及体腔内存在的大量的微生物,这些细菌,病毒,真菌等与人体形成了“超生物体(superorganism)”[8],与人体建立了相互制约相互依存的共生关系,对人体的健康及疾病状态都有很大的影响。成年健康女性的阴道菌群以厌氧菌为主,据有关报道厌氧菌与需氧菌的比例大概在5∶1,此比例会随着女性的年龄及激素水平的变化而发生相应的变化[9,10]。阴道菌群的状态最易受到身体内外因素的影响,造成阴道菌群失调。阴道微生态的平衡与失衡是阴道微生态研究的核心,阴道微生态的改变即阴道微生态失衡会打破“超生物体(superorganism)”与宿主形成的相互制约相互依存的共生关系,同时也打破了防止病毒、细菌入侵的第一道天然屏障[11-16]。随着阴道微生态平衡理论的发展,一些妇科疾病及妇科肿瘤的发生发展与阴道微生态关系的研究越来越受到重视。从以上数据可以看出:本地区女性HPV感染阳性率19.5%(90/462%)较之2015年HPV感染阳性率[17]明显下降。40~<50岁和30~<40岁是女性HPV高发人群,虽然大多数的HPV感染能够被宿主自行清除,但仍有一部分人会持续感染,所以定期HPV基因分型检测对30~<50岁的女性非常有必要。除高危型HPV45和低危型HPV40无人感染外,其余23种型别均有感染。高危型HPV感染为主,感染率为14.1%(65/462%),仅HPV16感染患者20例,是最容易感染的型别,与其他各型别比较,感染差异显著;低危型HPV感染除HPV40无感染患者外,其他型别感染率无明显差异;单一型感染有61例,占HPV阳性的67.78%(61/90%),其中单一高危型感染39例,疑似高危型感染9例,单一低危型感染13例;两型及以上感染HPV有29例,占HPV阳性的32.22%(29/90%),其中两型及以上高危型和高低危混合型HPV感染的各13例,两型及以上低危型HPV感染仅3例。以单一型高危型HPV感染为主,高危型和高低危混合型HPV感染位居第二。高危型HPV16感染患者最多,而HPV16有潜在的致癌性与宫颈癌鳞癌关系非常密切;所以对此人群定期进行HPV基因分型检测可以有效预防宫颈癌的发生。HPV感染组阴道菌群失调的阳性率为50%,未感组阴道菌群失调的阳性率为17.5%,HPV感染组有炎症者阳性率为100%,未感组有炎症者阳性率为57.5%,HPV感染组阴道分泌物pH值>4.5的人群占总数的88%,未感照组中阴道分泌物pH值>4.5的人群占总数的为58%,HPV感染组中有大肠埃希菌等需氧菌感染的阳性率为44.5%,未感照组有大肠埃希菌等需氧菌感染阳性率为25%,HPV感染组中有细菌性阴道病阳性率为44%,未感组中有细菌性阴道病的阳性率为25%,HPV感染组中阴道保护性黏蛋白屏障被破坏,阴道黏膜处于易感状态的阳性率为42%,未感组中阴道保护性黏蛋白屏障被破坏,阴道黏膜处于易感状态的11例,阳性率为27.5%,感染组和未感组差异均有统计学意义(P<0.05)。基于上述数据,HPV的感染与阴道微生态失衡之间密切相关。阴道微生态失衡与HPV感染又互为结果[18-21],但起始阴道微生态以什么样的机制和方式作用于机体,使人体容易感染HPV,还有待进一步研究。

作者:刘红敏 陈静 居艳梅 何永正 张洪霞