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EB病毒感染实验室诊断研究进展

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时间:2019-09-06 07:04
作者:admin666
摘要:EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)DNA载量和血清学抗体检测是当前实验室最主要的两个诊断手段。不同的检验项目和标本类型具有不同的临床意义和适用范围,对不同EBV感染相关疾病需选择合适的项目和方法。本文对检测EBV技术及在相关疾病的运用做了简单概括,并对EBV感染的免疫功能、细胞因子及相关基因检测临床应用进行了概述,其中淋巴细胞亚群分型及比例有助于评估IM患者的感染阶段和免疫状态,CAEBV患者Th17计数和Th17在CD4+T淋巴细胞的比例均明显升高;CAEBV、EBV-HLH患者免疫球蛋白和补体降低;多种EBV感染相关疾病IL-10的表达水平升高;鼻咽癌及其他EBV相关恶性肿瘤表达LMP2A;EBV转化B淋巴细胞多种基因表达上调或下调。

关键词:EB病毒感染;DNA载量;细胞因子;相关基因

EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)属于4型疱疹病毒,主要感染人的淋巴细胞和上皮细胞,分活动性感染和潜伏感染两种状态,潜伏感染和终身携带是EB病毒感染的重要特征,人群对其普遍易感,主要通过唾液传播。我国3岁前儿童的血清中血清反应性已超过50%,8岁后达到90%以上[1]。人体感染EBV后病情轻重不一,多数患者症状轻微,但严重时可累及全身各器官,甚至恶变危及生命。与其相关的良性疾病[2]有传染性单核细胞增多症、慢性活动性EB病毒感染、急性上呼吸道感染[3]、病毒性心肌炎[3]、支气管炎或支气管肺炎[3]、肝炎综合征[4]、逆行性牙髓炎[5]及相关皮肤疾病[6]等,恶性疾病有鼻咽癌、胃癌[7]、宫颈癌[8]及淋巴瘤等[9]。因此,如何及时准确的实验室诊断EBV感染显得尤为重要,不同疾病选择相适应的材料和方法有助于临床对EBV感染时相、机体状况和发生不良转归的风险进行评估。

1EBV-DNA测定

聚合酶链反应(PCR)是一种快速、可靠的DNA量化方法,EBV-DNA阳性是EBV存在的直接证据。由于EBV在淋巴细胞中无处不在且持续存在,仅仅检测EBV-DNA阳性就不足以诊断EBV相关疾病。探索EBV发病机制、诊断EBV相关疾病就必须测量EBV负荷。病毒不同感染状态和分布不同,采用不同类型的标本,EBV-DNA测定结果的解释因标本来源的不同而有不同。在慢性活动性EB病毒感染(CAEBV)、传染性单核细胞增多症(IM)和EB病毒相关噬血细胞淋巴组织细胞增生症(EBV-HLH)等急、慢性活动感染患者病毒主要感染淋巴细胞,检测全血DNA;鼻咽癌(NPC)患者中EBV-DNA主要来源肿瘤细胞,以游离的状态存在,检测血浆EBV-DNA。咽拭子和宫颈脱落细胞学检测有助于发现相应部位感染状态。有研究表明,患者生存时间以EBV-DNA1×105拷贝数/mL为界做比较,拷贝数越高患者生存时间越短。EBV-DNA水平的下降预示患者预后越好[10]。正常人外周血由于潜伏感染的存在,单个核细胞常检出低载量的EBV-DNA,通常低于200拷贝数/mL。IM患者活动感染时血浆或淋巴液中一般可达103~105拷贝数/mL。感染控制时即潜伏期血浆EBV-DNA可能检测不到,但在外周血淋巴细胞中的仍可检测出EBV-DNA较高滴度,并维持数月到1年。反复感染CAEBV患者EBV-DNA可达105~106拷贝数/mL甚至更高,EBV-HLH患者一般在104~106拷贝数/mL之间。

1.1全血EBV-DNA载量测定

全血EBV-DNA检测适用于潜伏期或活动感染期结束后,此时血清或血浆中病毒几乎被清除,能及时检测出存在于细胞内的EBV-DNA载量,评估疗效和预判不良转归最合适[11]。样本稳定性好,48h内4℃储存病毒载量稳定[12]。儿童IM早期诊断中检测全血EBV-DNA载量AUC为0.944,最佳临界值为2.19×104IU/mL时,诊断价值大,敏感度89.6%,特异度82.7%[13]。有研究报道182例疑似IM患儿EBV-DNA检测阳性率显著高于EBV-IgM检测阳性率。84例EBV-IgM与EBV-DNA阳性且有临床表现的患儿应用更昔洛韦进行治疗后7d及治疗后10d,患儿EBV-DNA检测阳性率显著高于EBV-IgM检测阳性率[14]。由此可见全血EBV-DNA检测能检出低复制情况,对感染早期诊断和治疗后恢复期的评估有很大意义。此方法的缺点是操作繁琐,定量结果受淋巴细胞分离效率的影响大。使用核酸释放剂法测EBV-DNA其检出率为90.0%,最低检出限为400拷贝数/mL,柱提法检出率62.6%,最低检出限为900拷贝数/mL,核酸释放剂法明显优于柱提法[15]。

1.2血浆或血清

EBV-DNA载量测定血清或血浆DNA检测适用于感染活动期的评估,是鼻咽癌诊断和分期重要指标。活动感染期时血浆或血清EBV-DNA载量高常为阳性,感染控制恢复期时血浆或血清中的病毒被清除载量低常为阴性,是一个可以很好反应感染活动期的指标。儿童EBV感染诊断中血浆EBV-DNA阳性率和拷贝数均明显低于全血[16],CAEBV、IM和EBV-HLH等急、慢性活动感染患者的活动期血浆或血清中的EBV-DNA多是由于细胞裂解、死亡释放的,不能够反映实际EBV-DNA水平,故诊断价值不如全血。EBV急性感染患儿血浆EBV-DNA阳性率为22.2%,平均载量为3.72lgCopies/mL,感染控制后血浆EBV-DNA转阴率2周为84.8%、2个月为93.9%[17]。血浆EBV-DNA一旦检测出阳性提示患儿往往处于活动感染期,检测为阴性不能排除是否存在急性感染,需与全血联合检测。鼻咽癌患者中EBV-DNA主要存在于患者的血浆中,血浆中的EBV-DNA主要来自肿瘤细胞且以游离的状态存在,血浆EBV-DNA测定已经被认为是鼻咽癌患者长期生存率和远处转移预后的重要指标[18]。有研究表明[19],初诊鼻咽癌患者EBV-DNA总阳性检出率为82.97%,临床早期(Ⅰ期+Ⅱ期)阳性检出率(61.00%)低于临床中晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)阳性检出率(89.91%),Ⅲ期+Ⅳ期EBV-DNA载量中位值5789(733,53950)拷贝数/mL高于Ⅰ期+Ⅱ期中位值101(0,1542)拷贝数/mL,可作为鼻咽癌诊断和临床分期的分子指标。血浆DNA检测不受淋巴细胞分离效率的影响,操作步骤简化,结果重复性好。

1.3咽拭子样本检测

EBV-DNA有研究表明定量荧光PCR(QF-PCR)检测儿童EBV感染咽拭子,EBV-DNA阳性率可达52.00%,与血清学检查检测EBV符合率是一致的,且QF-PCR灵敏度更高,联合检测更有意义[20]。此方法取材简便、无损伤,但由于EBV定植于人咽喉部,潜伏期和活动期都可检出,意义有限,一般作为流行病学调查。

1.4脱落细胞

EBV-DNA检测选取病人宫颈脱落细胞进行EBV-DNA检测,发现宫颈癌组EBV的阳性表达率为69.23%,显著高于正常宫颈炎组的3.13%。低分化组宫颈癌组患者HPV+EBV阳性表达率高于高中分化组,Ⅲ+Ⅳ期患者HPV+EBV阳性表达率高于Ⅰ+Ⅱ期患者,浸润型患者HPV+EBV阳性表达率高于其他三型患者,淋巴转移组患者HPV+EBV阳性表达率高于无淋巴转移组,HPV(+)+EBV(+)患者的存活率明显低于HPV(+)组患者和EBV(+)组患者[6]。EBV-DNA在宫颈癌临床分期和分级中阳性表达率逐渐增加,对宫颈癌诊断及预判不良转归有重要的意义。

1.5EBV-DNA的定量检测存在的问题

目前国内EBV工作标准品大多是厂商自主定值所得,缺少统一的标准导致检测结果差异较大,各实验室间可比性差。同时也缺乏可溯源的质控品对实验室检测结果进行评价[21]。不同标本处理过程及实验方法的不同也会造成结果差异,可应用自动化核酸提取仪和加强实验室人员培训加以解决。

2EBER原位杂交检测

EBERs是EBV编码的双链小RNA,是EBV表达产物,在EBV感染的细胞核中以高拷贝数存在,目前EBER原位杂交是判断器官组织标本EBV感染的金标准。此方法可在组织细胞中迅速定量定位,敏感性高特异性强、细胞形态保持好、操作简便、染色结果稳定可靠。适用于EB感染相关的肿瘤组织检测。如EBV相关性胃癌几乎所有癌细胞EBERs均呈阳性,占所有胃癌8.2%,好发于男性近胃端。预后好于EBV阴性胃癌[5]。也可用于鉴别诊断,如鼻咽癌和其他咽喉部肿瘤的鉴别。但其对新鲜肿瘤组织要求不小于1cm×1cm×0.5cm。

3EBV血清抗体检测

3.1抗体检测

EBV相关抗体一般包括壳抗原的IgM抗体(VCA-IgM)、壳抗原IgG抗体(VCA-IgG)、核心抗原抗体(EBNA-IgG)和早期抗原抗体(EA-IgG)。其中,VCA-IgM常作为感染的直接证据,但消失较快,易漏诊。VCA-IgG、EBNA-IgG感染后可持续较长时间,可动态检测观察病人滴度高低及变化,推测病人是否处于感染期,EBNA-IgG一般为出现临床症状后3~4周出现,EBNA-IgG和高亲和力的VCA-IgG的出现提示患者为恢复期或既往感染过EBV。早期抗原抗体(EA-IgG)持续时间短,一般检测不到,慢性活动性感染时持续阳性且滴度高。除了上述常用抗体,还有EBV抗衣壳抗原VCA-IgA抗体、抗早期抗原EA-IgA抗体、抗立即早期抗原Rta-IgG抗体。单独应用VCA-IgA检测NPC敏感度最高达90.3%赚钱的项目,但特异性差容易导致误诊。单独应用EA-IgA特异度最高达95.1%,但敏感度差容易导致漏诊。单独应用Rta-IgG抗体敏感度和特异度位于VCA-IgA和EA-IgA之间,诊断效率最好。联合检测三项抗体能够更大程度反映EB病毒相关抗原的表达,NPC诊断的敏感度达94.1%,特异度达98.9%,故三项抗体联合检测已广泛应用于NPC筛查中[22]。EBV血清学抗体由于长期存在,不能动态反映EBV载量和病情的变化,诊断价值与监测病情不如EBV-DNA定量测定。但方法优点是快速,费用相对较低。

3.2方法

目前主要有化学发光免疫分析法(CLIA)、酶联荧光分析法(ELFA)及酶联免疫吸附试验法(ELISA)。有研究[23]分别采用此三种方法检测EBV-VCAIgM,比较它们诊断EBV急性感染的价值,CLIA、ELFA、ELISABV诊断急性感染的灵敏度分别为94.2%、82.7%和80.8%,特异度为分别为91.1%、88.9%和91.1%。CLIA在标本血红蛋白水平达8g/L,三酰甘油达30000mg/L时均不受干扰。CLIA是目前测定EBV-VCAIgM较灵敏的定量检测方法,优于ELFA和ELISA,适用于临床EBV感染的早期诊断。

4其他相关免疫学检测

4.1异型淋巴细胞检测

有研究表明EBV阳性者异型淋巴细胞为12.44%±10.69%,高于EBV阴性者3.53%±2.72%和健康对照0.33%±0.66%,差异均有统计学意义(P<0.01)。EBV感染时,外周血异型淋巴细胞比例显著增高,外周血异型淋巴绝对值与病毒DNAcopy值呈正相关关系[24]。此方法对人员检测能力有一定要求,影响因素多,其他疾病也可出现异型淋巴细胞,但对实验室设备要求低,可作为初步快速诊断辅助性检测指标,适用于广大的基层医院。

4.2免疫功能及细胞因子检测

EBV感染时先受累B淋巴细胞,B淋巴细胞感染后增生活跃其抗原性发生改变后可引起T淋巴细胞防御反应,形成细胞毒性效应细胞直接破坏受染的B细胞,故感染初期CD19+的B淋巴细胞损耗增多下降明显,T细胞转化为细胞毒性效应细胞的增多,导致T细胞亚群的失衡,CD4+/CD8明显下降。随着病毒的逐步清理,感染后期T细胞亚群的比例恢复正常。流式细胞术检测CD19、CD8、CD4+/CD8判断患者的感染阶段评估免疫功能有一定的意义[25]。IM急性期Foxp3mRNA表达水平显著降低,CD5+Treg数量降低与Foxp3mRNA表达呈正相关关系。TLR2和TLR9在IM急性期表达上调[26]。CAEBV和EBV-HLH的C3、C4、IgA、IgG及IgE水平明显低[27]。在多种EBV感染相关疾病中,IL-10的表达水平升高[28]。IM患者血清中含有悠赚网短暂高水平的IL-10,CAEBV患者的IL-10水平异常增高与预后密切相关[29],IL-10在内的高细胞因子“风暴”是EBV-HLH的病理生理基础[30]。NPC患者体内高表达IL-10,早期即刻蛋白Zta(immediateearlytransactivator)的NPC细胞可促进单核细胞产生IL-10[31]。CAEBV患者IL-17水平无显著升高,Th17计数以及Th17在CD4+T淋巴细胞的比例均明显升高[32]。可溶性白细胞介素(白介素)-2受体(solubleIL-2receptor,sIL-2R)是HLH的诊断指标之一[33]。

4.3EBV相关基因检测

EBV感染细胞中表达的病毒潜伏期基因主要包括EBV核抗原家族(EBNAs):EBNA1、2、3A、3B、3C和LP;潜伏膜蛋白(LMP)1、2A和2B;EBV编码的小RNA(EBER)S、1和2;以及BARF0的转录产物。所有EBV感染细胞中均可表达EBNA1,EBV在感染细胞中根据不同潜伏状态选择性表达潜伏期基因。健康携带者只表达EBERs,NPC和其他EBV相关恶性肿瘤除表达EBNA1、EBERs和BARF0外,大多还伴有LMP1、2A基因的表达,其中LMP2A是目前公认的病毒癌基因之一[34]。LMP2A可诱导信号转导和转录活化蛋白3(pSTAT3),引起EBV感染的胃癌上皮细胞DNA甲基转移酶(DNMTl、DNMT3A、DNMT3B)表达上调,随后驱动肿瘤抑制基因(如PTEN、P16、p73等)DNA超甲基化,最终导致肿瘤抑制基因沉默[35]。利用人全基因组寡核苷酸基因表达谱芯片筛选正常人外周淋巴细胞和EBV转化B淋巴细胞株之间的差异,发现具有统计学意义的基因差异有1587个,其中上调基因897个,下调基因690个,这些基因主要涉及P53、PI3K-Akt、Ras、MAPK、Tolllikereceptor、WNT、TNF和JAK-STAT等信号通路,与细胞周期调节,B细胞增殖、活化、分化和细胞因子产生,DNA复制、损伤修复,病毒与宿主相互作用及病毒致癌作用等相关[36]。EBV病毒感染与多种疾病相关,目前检测手段主要是血清学抗体和核酸载量检测,血清学检测因受检者年龄、免疫状态及就诊时间的差异常导致漏诊或误诊,某些情况下,EBV-IgM易出现阴性或假阳性,例如在2岁[37]以下及部分免疫反应低下的患儿或患儿被巨细胞病毒、钩端螺旋体、弓形虫等感染时。VCA-IgM阳性和低亲和力VCA-IgG是明确现症感染最主要的两个指标。EBV抗体是用于EBV感染辅助诊断及流行病学筛查的重要指标。CLIA是目前测定EBV-VCAIgM较灵敏的定量检测方法,优于ELFA和ELISA。核酸载量检测是EBV感染的直接证据,全血检测能评估到病毒低复制情况,对感染早期诊断和治疗后恢复期的评估有很大意义。活动感染期淋巴破坏病毒释放入血,血清或血浆的DNA检测可诊断并对感染状态病情进行评估。鼻咽癌患者中EBV-DNA主要存在于患者的血浆中,检测血浆和全血区别不大,但全血样本处理较血浆繁琐。咽拭子、脱落细胞学及EBER原位杂交检测可检测特定组织部位的EBV感染情况,能定位定量。不同疾病应选择最适样本,标准化操作是DNA检测技术发展的目标。EBV感染引发体内一系列复杂的免疫应答反应,细胞免疫、体液免疫及基因表达发生了一系列变化,疾病产生发展机制的研究使一些相关性指标被检测作为辅助诊断指标。

作者:陈刚 单位:绵阳市中心医院检验科