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丙型肝炎病毒感染机制研究

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时间:2019-09-06 07:04
作者:admin666
开个什么店赚钱摘要:丙型肝炎病毒(HCV)感染已经成为严重威胁人类健康的社会公共卫生问题,经过长期的探索和研究,仍缺乏高效的预防和治疗方法。HCV是如何进入肝细胞,如何在肝细胞复制及在肝细胞内持续存在等关键问题尚未清楚。了解HCV的感染机制,有助于为新的抗HCV药物和策略的研发提供思路,相信随着更深入研究的进行,其感染机制会更加明了。

关键词:丙型肝炎病毒;感染;肝细胞

丙型肝炎病毒(HCV)感染是导致全世界慢性肝病的主要原因之一,全球大约有1.85亿人感染该病毒[1],其中80%以上转为慢性肝炎,20%转为肝硬化,且肝硬化患者中约10%转为肝癌[2]。目前国际公认的丙型肝炎标准治疗方案为聚乙二醇干扰素α联合利巴韦林,但该治疗方案的临床不良反应明显,持续应答率(SVR)较低,难以有效清除HCV。近几年研发的直接抗病毒药物(DAA)主要针对HCV的NS3/4A蛋白酶、NS5A蛋白酶及NS5B多聚酶,但DAA上市时间较短费用昂贵,且药物安全性和长效性有待报道。大量研究表明,HCV感染机制的探寻是彻底解决治疗问题的突破口,但由于缺乏理想的动物模型和体外培养体系[3],该病毒是如何进入肝细胞,如何在肝细胞复制及在肝细胞内持续存在等关键问题尚未清楚。本文就目前HCV感染机制研究现状进行简要综述。

1HCV进入肝细胞过程

HCV通过血流进入人体,以肝细胞作为其主要靶细胞。病毒颗粒通过肝细胞膜是HCV感染肝细胞的第一个重要步骤,其进入肝细胞是一个动态的过程,涉及多个步骤、多个宿主细胞因子[4]。有学者在以病毒基因组染色体HCVRNA转染的人肝癌细胞系-7为模型的研究中指出,HCV入胞机制的可能大致轮廓为:病毒颗粒首先与宿主低密度脂蛋白受体黏附,启动病毒进入的第一步,而后HCV的E2糖蛋白和宿主的跨膜蛋白CD81、清道夫受体SR-B1相互作用形成HCVE2-CD81/SR-B1复合体;E2-CD81/SR-B1复合体诱导表皮生长因子(EGFR)及Hras信号通路的激活,引起HCVE2-CD81/SR-B1复合体与肝细胞基底膜上紧密连接蛋白CLDN1、OCLN相互聚集形成细胞群;CD81-CLDN1细胞群的内在化由网格蛋白介导的胞吞诱导引起膜融合[5]。在受体、共受体及辅助因子的协同下,E1、E2蛋白促进HCV和宿主胞内体的融合并内化入胞,完成HCV对肝细胞的靶向结合。在HCV跨膜具体机制研究中,P?REZ-BERNA等[6]通过对HCV包膜糖蛋白多肽库的分析,鉴定出E1和E2中可能参与融合作用的肽段,推测在E1和E2结构蛋白中都存在参与完成融合过程的功能区。关于HCV的融合机制可能与黄病毒类似,在受体与低pH的双重诱导下,HCVE1、E2糖蛋白发生构象转变,暴露出融合肽/环并插入靶膜,引起构象重排,形成融合诱导型同源三聚体,驱动病毒包膜与内体膜发生融合,从而使病毒衣壳游离,病毒RNA释放入胞[7]。然而由于E1晶体结构的缺失及E1、E2蛋白体的复杂性,加之HCV包膜蛋白三维立体结构的缺失,大大阻碍了分子水平上HCV融合机制的研究。研究发现,NPC1L1受体参与HCV在细胞间的传播,以及晚期膜融合的重排、转铁蛋白-1受体作为E1/E2蛋白特异性受体介导HCV的融合过程、血清反应因子结合蛋白1与CD81结合后参与HCV的膜融合并调节宿主细胞的渗透。因此,在HCV进入肝细胞过程中,细胞因子及其参与的信号通路机制对病毒进入细胞、病毒颗粒脂蛋白重排、CD81诱导信号通路的理解至关重要。

2HCV在肝细胞内复制机制

HCV进入肝细胞后,经历多蛋白的翻译和加工、RNA的复制及病毒颗粒的包装、装配和释放等过程完成其整个生命周期。基于HCV体外培养模型的限制性,病毒的整个生命周期还未完全了解,许多实验尝试建立HCV组织培养模型,但迄今为止尚未成功建立支持HCV装配和释放的模型。但随着HCV假病毒颗粒及HCV体外细胞培养模型的建立,关于HCVRNA复制的研究已取得了巨大的进步。首先,HCVRNA附着于肝细胞核糖体上,经5′UTR的IRES介导直接结合起始因子eIF,并利用40S核糖体亚单位开始翻译,在eIF2-Met-tRNA-GTP三元复合物、eIF3、60S亚基共同形成的活性80S核糖体上完成装配后翻译出多聚蛋白,通过细胞信号肽酶及其裂解作用,使多聚蛋白N-末端的结构蛋白与多聚蛋白分离,同时病毒编码的NS2-3蛋白酶自身催化NS2/NS3及NS3-4A丝氨酸蛋白酶在多聚蛋白下游4个位点处催化肽链的裂解。其次,多聚蛋白完成加工处理,产生并翻译10种成熟病毒蛋白(Core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)组成病毒复制复合体。最后,病毒复制复合体在内质网膜结构衍生出的“膜网络”中进行复制,在依赖RNA的RNA聚合酶的作用下[8],HCV以亲代RNA为模板形成负链复制中间体,再从互补的负链复制出多股子代正链RNA,生成的子代RNA分子可进一步翻译成新的病毒蛋白质或合成复制型,起模板作用或组装成病毒。如此反复循环,生成大量HCV。在这个过程中,众多microRNA参与HCV复制的调节,比如肝脏特异高表达的miR-122可通过与HCV基因组5′非翻译区的两个结合位点相互作用来影响IRES的功能,增加HCV的翻译和复制,从而正向调节其表达[9]。研究还发现,抑制miR-122表达的ASO转染Huh-7细胞后,miR-122基因的表达抑制导致病毒RNA复制子的数目下降80%,同时HCV-RNA复制子水平也明显降低,HCV蛋白质表达下调。这提示miR-122表达的降低可导致HCV-RNA数目减少,并可影响HCV-RNA的复制和翻译[10]。相反,miR-122联合调节蛋白Ago2,有助于增强HCV的嗜肝性,也通过核糖核酸外切酶Xrn1稳定病毒RNA并阻止其降解,从而促进病毒RNA的高效复制[11]。最新研究表明,miR-122调节的另一个核糖核酸外切酶Xrn2也可增强HCV病毒的复制,阻止HCVRNA的降解,然而Xrn2增强病毒复制可能只对少数基因型有影响,如复制力较强且产生细胞病变效应的JFH1[12]。这些研究提示了microRNA在HCV复制过程中的重要性,以及肝脏特异性microR-NA,如miR-122,可能具有作为抗HCV靶作用位点的潜在价值。此外,还有研究通过RNA干扰筛选试验发现了许多可能参与HCV复制的宿主辅助因子,如被认为是关键性宿主因子的磷脂酰肌醇4-激酶Ⅲ(PI4K-Ⅲα)。TAI等[13]通过建立非复制的网状膜形成模型发现,PI4K-Ⅲα活性的丧失会导致HCV病毒复制复合体膜结构形态的显著变化,抑制其表达会导致双层膜囊泡和HCV复制复合体的聚集,影响膜网络的形成。有研究证实了PI4K-Ⅲα对维持病毒复制区网状膜结构的完整性起重要作用[14]。PI4K-Ⅲα磷酸化磷酸肌醇并形成磷脂酰肌醇4-磷酸(PI4P)。在HCV感染过程中,PI4K-Ⅲα和病毒NS5A蛋白相互作用引起PI4P水平增加,PI4P对HCV病毒的复制有重要作用,其水平的下降或过量表达都将影响HCV的复制[15]。

3HCV在肝细胞内持续存在机制

3.1HCV的高度变异性

由于RNA聚合酶缺乏3′-5′核酸外切酶校对功能,在HCV复制时会随机插入错误配对的核苷酸,导致其编码蛋白产生无义、同义或错义突变,从而改变蛋白氨基酸序列,产生复制频率高和能逃避宿主免疫监视的优势变异株。研究发现,HCV高度变异,每一个复制周期约有10-4个可替换位点,高度突变涉及整个基因组范围,包括5′UTR、E2、NS2、NS3和NS5A等区都存在,可产生基因型序列极为相似,仅一些位点存在差异的“准种”病毒群体[16]。准种的存在使得病毒产生可逃避宿主体液和细胞免疫的逃逸突变株,也是导致抗HCV疫苗的失败及其耐药性的原因之一。此外,HCV基因组的E2区含有两个高变区HVR1和HVR2,极高突变率的两个高变区使得病毒可选择逃逸抗体中和。另外,慢性丙肝患者体内每天1010~1012个病毒粒子的产生率和病毒极短的半衰期为病毒变异个体的产生提供了重要物质条件。

3.2免疫清除能力有限

急性HCV感染者中,20%~30%可以自发性清除病毒,然而绝大多数感染者都因为持续的固有免疫和适应性免疫反应而无法清除病毒,逐渐发展为慢性感染,导致病毒在机体内持续存在。固有免疫是宿主细胞抵御病毒感染的第一道防线,许多受体分子和免疫因子都参与了HCV的感染过程。Toll样受体(TLRs)识别HCV双链RNA中间体,诱导免疫因子的产生,同时人视黄酸诱导基因RIG-I识别HCV3′-非编码区的poly-u/uc序列,诱导IFNs的产生,促进细胞的免疫反应和CTL应答,从而清除细胞内病毒[17-18]。固有免疫细胞通过不同的作用机制来清除病毒,抑制病毒的复制和传播,但HCV核心蛋白通过阻断JAK/STAT信号传导通路负调控IFN反应途径[19],诱导细胞因子信号抑制物-3的表达,导致活化STAT1减少,并与STAT1直接结合阻止其磷酸化,激活下游抗HCVISGs,干扰ISGs的生成[20];HCV的NS3-4A蛋白酶可通过裂解宿主的转接蛋白MAVS、TRIF,从而抑制感染细胞的RIG-I经典通路和TLRs介导的Ⅰ型和Ⅲ型IFN信号通路,削弱宿主细胞的免疫清除能力,达到逃逸宿主固有免疫应答的目的[21];HCVNS4B也可通过干扰STING与MAVS、TBK1的相互作用来抑制IFN的产生[22-23]。固有免疫还受到IL28B基因的调节,IL28B基因的编码产物IFN-λ3可与受体结合激发下游信号通路,并激活ISGF3和STAT1二聚体,诱导参与炎症与免疫反应基因的表达[24]。在Huh7细胞中,HCV及其病毒蛋白可干扰TLR3信号转导通路,并且抑制胞内的IFN-λ1/ISG表达,损伤机体的固有免疫反应[25],导致适应性免疫在家做什么赚钱的失活和功能障碍,从而影响宿主的免疫清除能力,引起慢性感染[26]。机体固有免疫抗病毒感染的失败诱导宿主适应性免疫的发生,CTL对于控制HCV感染作用显著,能够直接杀死感染的细胞,并分泌多种抗病毒细胞因子。急性HCV感染者体内存在较强、较广的抗原特异性CTLs,并可通过CTL生成IFN-γ来清除病毒,而慢性感染者通过连续的抗原刺激抑制了CTLs细胞受体的表达,从而导致了CTLs功能失调。早期HCV感染诱发CTL反应,但CTL的作用较弱,不能杀伤表达相应抗原的靶细胞,不能彻底清除病毒,从而导致HCV病毒持续存在。HCV病毒的C区、E区、NS2、NS3都含有CTL抗原表位,但这些CTL抗原表位均呈现出较强的变异性,通过CTL抗原表位的变异,病毒可逃避细胞免疫监视,实现免疫逃避[27]。HCVE2蛋白和其编码的一个短RNA片段可抑制T细胞受体介导的信号,从而导致T细胞功能障碍和机体适应性免疫受损,导致HCV慢性感染[28]。E2与IFN诱导的蛋白激酶PRK结合,抑制了PKR的活性并阻止真核起始因子2(eIF2a)的磷酸化,从而干扰PKR对病毒翻译、增殖的调控,阻止IFN介导的翻译关闭,这也是病毒免疫清除能力受限的重要因素之一[29]。修复CD8+T细胞的免疫反应,抑制干扰T细胞免疫功能的病毒复制,从而恢复T细胞的功能是治疗HCV感染的重要途径。

3.3肝外隐匿性感染

HCV具有很强的嗜肝性,然而通过检测外周血淋巴细胞(PBMC)、骨髓、中枢神经系统中HCV正链和负链RNA以及病毒蛋白,证实了HCV存在着潜在的肝外复制场所[30]。即使血清中检测不到HCVRNA,PBMC中可能仍存在HCV。当患者免疫力受抑,HCV则极可能再次被激活引起病毒血症。隐匿存在于PBMC中的HCV不足以引起强烈的IFNs免疫反应来清除病毒,以致于HCV在PBMC中持续存在,从而成为影响丙肝患者SVR和治疗后复发的重要因素[31]。

4小结

HCV感染已经成为严重威胁人类健康的社会公共卫生问题,经过长期的探索和研究,仍缺乏高效的预防和治疗方法。随着HCV感染机制的深入研究,对其整个生命周期及其在体内持续存在的机制有了更进一步的认识,但仍有很多问题尚待解决。了解HCV的感染机制,有助于为新的抗HCV药物和策略的研发提供思路,相信随着更深入研究的进行,其感染机制会更加明了。

作者:朱紫衣 叶雨笙 江忠勇 熊杰 单位:西南医科大学临床医学院 成都军区总医院检验科